開發(fā)全自動多級過濾分離外泌體儀器，并通過提取人自體脂肪干細胞來源外泌體進行性能評價。方法：確定儀器分離工藝流程，設(shè)計儀器結(jié)構(gòu)，完成儀器軟硬件開發(fā)；從患者獲取自體脂肪，消化后獲取脂肪干細胞并進行培養(yǎng)傳代，收集第三代脂肪干細胞培養(yǎng)上清液并初步離心，取上清加入第一級儲液罐中，通過儀器過濾，將獲取的第三級濾液進行離心并提取外泌體。通過透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，TEM）觀察外泌體的形態(tài)，進行納米顆粒跟蹤分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA），分析粒徑、顆粒濃度，并通過蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測脂肪干細胞來源外泌體的特異性蛋白表達，表達指標(biāo)包括CD63、CD81、TSG101，同時檢測GM130判斷檢測樣品中囊泡被污染的程度。結(jié)果：完成了全自動多級過濾分離外泌體儀器的開發(fā)，由儀器進行過濾濃縮并經(jīng)過離心后提取的脂肪干細胞來源外泌體，在透射電子顯微鏡的觀察下呈圓杯狀，通過納米顆粒跟蹤分析得到的外泌體大部分處于50nm-200nm之間，蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示：提取的外泌體中有CD63、CD81、TSG101的表達，外泌體獲得量達到75%，囊泡污染情況處于正常范圍內(nèi)。結(jié)論：全自動多級過濾分離外泌體儀器能實現(xiàn)外泌體高效快速分離，達到了臨床應(yīng)用的要求，為臨床外泌體的疾病治療提供了有力的支撐。

關(guān)鍵詞：外泌體；脂肪干細胞；過濾；濃縮；提取

Multistage Filtration Based Fully Automated Exosomes Separation Instrument and Its Performance Evaluation

Zeng Yangtian¹ Zheng Yi² Liu Kai^2* Li Hong^1*

1(Hangzhou Baiqiao Medical Technology Co.,Ltd., Hangzhou 310018)

2 (Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011)

3 (EVERFINE Test and Calibration Technology Co., Ltd, Hangzhou, Hangzhou 310053)

Abstract: Objective: to develop a fully automated multistage filtration instrument for the separation of exosomes and to evaluate the performance by extracting human autologous adipose-derived stem cells(ADSCs) exosomes. Methods: To determine the instrument separation process, design the instrument structure and complete the instrument development of both hardware and software; to obtain and digest the autologous fat from patients, obtain and subculture the adipose-derived stem cells, collect the supernatant of the third generation adipose-derived stem cell culture and make initial centrifugation, add the supernatant to the first reservoir then filter through the instrument, centrifuge the obtained third stage filtrate and extract exosomes. The morphology of the exosomes was observed by Transmission Electron Microscope (TEM). Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) was performed to analyze particle size and concentration. Western Blot (WB)was used to detect the specific protein expression of the adipose-derived stem cells exosomes, which including CD63, CD81, TSG101 and GM130.And the Western Blot Method also was used to detect the contamination extent of vesicles in the assay samples. Results: The development of a fully automated multistage filtration and separation instrument for exosomes was completed. The adipose-derived stem cell exosomes, which extracted by the instrument after filtration and concentration and centrifugation, were observed in a circular-cup shape by TEM. Most of the exosomes obtained by NTA were in the range of 50 nm-200 nm. WB showed that the extracted exosomes contained the expression of CD63, CD81, TSG101 and CD81. Exosomes were obtained up to 75% and vesicle contamination was within the normal range. Conclusion: The fully automated multistage filtration and separation of exosomes instrument can achieve efficient and rapid separation of exosomes, which meets the requirements of clinical application and provides a strong support for clinical exosomes in disease treatment.

Keywords: Exosomes; Adipose-Derived Stem Cells; Filtration; Concentration; Extraction

引言

外泌體（exosome）是直徑在30～150nm的胞外囊泡^[1-3]，研究^[4-8]表明，外泌體廣泛存在于尿液、胸腹腔積液、乳汁、唾液等體液中，很多細胞可以分泌外泌體，如MSCs、血細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞、腫瘤細胞等。外泌體攜帶大量胞內(nèi)和胞外的生物信息，可作為細胞通訊和細胞外基質(zhì)重塑的媒介，與人類健康和疾病息息相關(guān)^[9-10]，通過霧化吸入MSC-EVs給藥途徑對于急性呼吸窘迫綜合征的治療有重大意義^[11]；朱紅艷^[12]課題組研究表明：CBSA/siS100A4能顯著抑制惡性乳腺癌細胞的生長；馬陶陶^[13]團隊揭示：外泌體介導(dǎo)腎小管上皮細胞與巨噬細胞之間交互對話在糖尿病腎病治療進程中發(fā)揮重要作用；張松英^[14]教授團隊發(fā)現(xiàn)：通過調(diào)控蛻膜NK細胞（母源性）的代謝水平從而改善蛻膜NK細胞分泌胎盤發(fā)育所需因子的水平。正是因為近些年來外泌體在臨床診斷、疾病治療、組織再生等方面逐漸凸顯出重要的價值，世界各國研究者對于外泌體特殊性質(zhì)、結(jié)構(gòu)的研究愈發(fā)深入。

傳統(tǒng)的外泌體分離方法有超速離心法、過濾法、免疫磁珠法、微流控芯片等^[15]，超速離心法因為儀器設(shè)備昂貴難以大范圍普及，免疫磁珠法由于夾雜其他外來成分難以進行臨床應(yīng)用，微流控芯片法雖然分離純度高，但是提取量很小，難以大量推廣，過濾法雖然技術(shù)成熟，但是目前處于手工處理階段，費勁、費時且容易造成污染^[16-17]。

本文針對過濾法進行改進，對過濾孔徑、過濾級數(shù)進行了完善，對整個過濾過程進行智能控制開發(fā)，以期達到適應(yīng)臨床高效、快速、安全應(yīng)用的要求，并對儀器的外泌體制備效果進行了實驗評價。

1 方法

1.1 儀器設(shè)計

1.1.1 儀器總體組成

儀器總體由兩個儲液罐、一個多級過濾單元、一個電機驅(qū)動器、柱塞泵、兩個壓力傳感器、一個電機、直線運動機構(gòu)、觸摸屏等部分組成（圖1）。整體由PLC與數(shù)據(jù)采集模塊控制，壓力傳感器的數(shù)值實時在觸摸屏上顯示，經(jīng)由觸摸屏實現(xiàn)人機交互，儀器有自動和人工兩種模式，根據(jù)工作場景進行切換。

1.1.2 儀器工作流程

使用儀器對目標(biāo)液體濃縮的流程如圖2所示：在一號儲液罐中加入液體，開關(guān)上電，控制器控制電機驅(qū)動器，由電機驅(qū)動器控制電機啟停，當(dāng)電機開啟，直線運動機構(gòu)帶動柱塞泵運動，吸液管將一號儲液罐中的液體吸入后，經(jīng)管路排入多級過濾單元，多級過濾單元的入口處和出口處裝有壓力傳感器，通過實時檢測一級穩(wěn)壓室和二級穩(wěn)壓室壓力傳感器的差值，根據(jù)差值大小來控制柱塞泵的開閉時間使得多級過濾單元內(nèi)的壓差恒定。致使液體能通過多級過濾單元，以達到自動過濾不同直徑微粒的目的，儀器運行結(jié)束后，將直徑小于多級過濾單元最底層濾膜直徑的微粒和廢液通過終端管路排入二號儲液罐中，實驗人員可以根據(jù)需要在多級過濾單元中獲取目標(biāo)產(chǎn)物。

圖1全自動外泌體提取濃縮儀

Fig.1 Automatic Exosome Filtration Instrument

圖2儀器工作流程圖

Fig.2 Instrument work flow chart

1.2 儀器性能評價

1.2.1 實驗材料

1.2.1.1實驗用主要試劑

脂肪干細胞培養(yǎng)添加劑（UltraGRO^TM，AventaCell BioMedical，美國）；PBS（Gibco，美國）；0.25%胰酶（Gibco，美國）；胎牛血清（Gibco，美國）；三抗（Gibco，美國）；α-MEM、低糖與高糖DMEM（Gibco，美國）；膠原酶（Collagenase NB4，Serva，德國）； BCA蛋白定量試劑盒（碧云天，中國）。

1.2.1.2實驗用主要儀器

一次性無菌10 cm培養(yǎng)皿（BD，美國）；100 kDa超濾管（Milipore，美國）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國）；酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific，美國）；微量電子秤（隆成儀器設(shè)備有限公司，中國）；流式細胞儀（Beckman，美國）；溫度可調(diào)節(jié)臺式離心機(Thermo Fisher Scientific，美國);血球計數(shù)板（上海市求精生化試劑儀器有限公司，中國）；溫度可調(diào)節(jié)搖床（太倉市華美生化儀器廠，中國）；恒溫水浴鍋（上海赫田科學(xué)儀器有限公司，中國）。

1.2.2 實驗方法

1.2.2.1脂肪干細胞的分離培養(yǎng)

本研究的脂肪來源于腹部或大腿內(nèi)側(cè)，為患者行抽脂術(shù)后的廢棄脂肪?；颊咭押炇鹬橥鈺?，同意捐獻廢棄脂肪用于醫(yī)學(xué)研究，研究方案已經(jīng)過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

獲取捐贈脂肪后，通過膠原酶消化脂肪，離心后提取原代脂肪干細胞。脂肪干細胞接種于含有脂肪干細胞培養(yǎng)添加劑的α-MEM培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng)皿中，于5%CO₂，37℃條件下培養(yǎng)。細胞接近80%-90%融合時，使用含EDTA的0.25%胰酶消化細胞進行傳代。使用第3代脂肪干細胞進行外泌體提取。

1.2.2.2脂肪干細胞來源外泌體提取

將收集第3代脂肪干細胞上清液倒入外泌體提取儀器進液罐中，使用儀器進行過濾操作。將收獲的濾液加入100kDa的milipore超濾管中，超濾法提取外泌體。以3000g，15-20min，4℃條件離心，至超濾管內(nèi)管上清液幾乎全被離心下去，再用PBS洗滌一次，離心至內(nèi)管僅剩余200-500μL含有外泌體的PBS。離心完成后，吸出含有外泌體的PBS，保存在4℃冰箱。

1.2.2.3脂肪干細胞來源外泌體鑒定

就目前的分離方法而言，很難得到特別純凈并且單一的外泌體，所以需要對經(jīng)儀器濃縮后離心所得到的外泌體鑒定。本研究根據(jù)國際細胞外囊泡學(xué)會制訂的標(biāo)準(zhǔn)采取三種方法進行鑒定，以保證鑒定的準(zhǔn)確性。①透射電子顯微鏡（TEM）觀察預(yù)處理后外泌體的形態(tài)^[18];②基于尺寸的納米顆粒跟蹤分析（NTA）：用光束照射外泌體中的粒子，通過粒子的散射光和布朗運動來記錄每個粒子的路徑，并且能確定粒子運動的平均速度和擴散系數(shù)，再經(jīng)由數(shù)學(xué)計算得出外泌體的濃度和尺寸分布^[19];③使用蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測外泌體表面的特異性蛋白marker ^[20]。

1.2.3 主要觀察指標(biāo)

①透射電子顯微鏡觀測脂肪干細胞來源外泌體形態(tài)；②納米顆粒跟蹤分析，分析獲取外泌體粒徑和濃度；③蛋白質(zhì)印跡法鑒定脂肪干細胞來源外泌體表達蛋白。

2 結(jié)果

2.1 脂肪干細胞形態(tài)

圖3（a）為清洗純化的脂肪，圖3（b）為第三代的人脂肪干細胞在倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察呈長梭型。

2.2 外泌體透射電子顯微鏡鑒定結(jié)果

如圖4（a）所示,在透射電子顯微鏡下脂肪干細胞來源外泌體大小在30nm-200nm之間，形態(tài)呈外泌體典型的圓杯狀。

2.3 外泌體標(biāo)志物蛋白質(zhì)印跡法鑒定結(jié)果

在國際細胞外囊泡學(xué)會所標(biāo)準(zhǔn)^[21]中，必須包含細胞內(nèi)體或外泌體質(zhì)膜蛋白、與外泌體分泌相關(guān)的胞質(zhì)蛋白，并排除一個非外泌體結(jié)構(gòu)或相關(guān)的廣域細胞質(zhì)蛋白，該囊泡才能稱之為外泌體，如圖4（b）所示蛋白質(zhì)印跡法檢測到外泌體質(zhì)膜蛋白CD63、CD81的表達以及分泌相關(guān)的ESCRT復(fù)合體蛋白中TSG101的表達，而幾乎不表達高爾基體蛋白GM130，證明所分離的產(chǎn)物含有外泌體，其純度較高。

2.4 外泌體納米顆粒跟蹤分析結(jié)果

如圖5所示，通過納米顆粒追蹤分析所得到的顆粒粒徑分布集中在30nm-200nm之間，顆粒的濃度結(jié)果，符合外泌體粒徑特征^[22]。

圖3 實驗材料。（a）實驗所用脂肪；（b）人脂肪干細胞的形態(tài)

Fig.3 Experimental materials.(a)Fat used in experiments；(b)Morphology of human adipose stem cells

圖4外泌體形態(tài)與特異性蛋白鑒定。(a)透射電子顯微鏡顯示的外泌體的形態(tài)特征;(b)蛋白質(zhì)印跡法檢測外泌體蛋白表達

Fig.4 Exosome morphology and specific protein identification.(a)Morphological characteristics of exosomes displayed by transmission electron microscopy;(b)Western blotting to detect exosome protein expression

圖5 NTA檢測外泌體粒徑分布
Fig.5 NTA detection of exosome particle size distribution

3 討論

對于多級過濾的全自動外泌體分離儀器進行的性能評價實驗，采用自體脂肪干細胞作為原材料，以自體脂肪干細胞提取外泌體的臨床意義在于：自體脂肪來源廣泛，且容易獲取，同時不會產(chǎn)生排異性，便于應(yīng)用。同時全自動多級過濾分離外泌體儀器采用非接觸式設(shè)計，加入了智能控制閉環(huán)設(shè)計，能有效的節(jié)省人工成本，使得提取的外泌體純度高、無污染，達到臨床所需外泌體標(biāo)準(zhǔn)。從實驗評價結(jié)果來看通過對脂肪干細胞來源外泌體的濃縮，離心提取，并經(jīng)過檢測外泌體的三個標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定：提取微粒是外泌體，并且污染度處于正常范圍內(nèi)，證明全自動外泌體過濾儀器對含外泌體的上清過濾濃縮，所得濃縮液進行分離可得到完整外泌體，外泌體提取所需處理時間遠小于傳統(tǒng)提取方法，達到臨床應(yīng)用的要求。

該儀器的完成能實現(xiàn)外泌體不同亞群顆粒大小（30-150nm）的精準(zhǔn)細分提取，為研究外泌體亞群結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了有價值的工具，為臨床治療提供了快速高效省力的手段，目前該儀器仍然存在一定的問題，部分外泌體會黏附于濾膜上導(dǎo)致產(chǎn)物損失以及活性喪失。在接下來的研究，會進一步改進外泌體提取儀，采用切向流等新型過濾方法，對該缺點進行糾正，減少濃縮液的浪費，以期達到更高的外泌體獲得量。

4 結(jié)論

全自動多級過濾分離外泌體儀器能實現(xiàn)外泌體高效快速分離，達到了臨床應(yīng)用的要求，為臨床外泌體的疾病治療提供了有力的支撐。

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